Az agy működésében szerepet játszó endocannabinoid vegyületek vizsgálata II.

Az agy működésében szerepet játszó endocannabinoid vegyületek vizsgálata 

Kutatási beszámoló 

Tóth Blanka 

2010.09.01-2010.12.31

A kutatást ebben az időszakban az endokannabinoid vegyületek kvantitatív meghatározására általam kidolgozott módszer (amit a 2010.02.01-2010.06.30 időszakra vonatkozó kutatási beszámolóban ismertettem) fejlesztésével folytattam.Az utóbbi időben a velünk kollaboráló biológus kollegák érdeklődése is megváltozott. Ezidáig elsősorban az anandamid meghatározás volt fontos, ez a helyzet azonban új mechanizmusok felfedezése miatt megváltozott. Így mindinkább fontossá vált a palmitoil-etanolamid és az oleil-etanolamid mérése, valamint egy hosszú szénláncú lipid is érdekessé vált a biológus kollégáknak.Ezért egyrészt módosítottam a módszert két belső standard használatával, valamint egy hosszú szénlácú (C20) lipidet is bevontam a vizsgálandó vegyületek körébe. Belső standardként a mérendő vegyületek deuterált származékát használtam: anandamid és oleoil-etanolamid 4-szeresen deuterált változatát. Ez két szempontból is előnyös: egyrészt ezen vegyületek endogén módon nem találhatók meg semmiképp a mintákban, másrészt kémiai viselkedésük megegyezik a mérendő anyagéval.A belső standard használata lehetőséget adott a mintelőkészítés javítására is. Egyrészt a pufferes oldatos homogenizálás helyett metanolos extrakciót alkalmaztam, másrészt az eddig használt acetonitriles fehérjekicsapás helyett szilárd fázisú extrakciós (SPE) módszert alkalmaztam (amely jóval több lépésből áll ugyan, de a több lépésből adódó több hibalehetőséget kiküszöböli a belső standard használata). A módszer előnye többek között, hogy nagyon tiszta minta nyerhető általa, valamint, hogy a mintaelőkészítés során nem hígul meg a minta. Ez nagyon fontos paraméter, hiszen ezen lipideket nagyon kis koncentrációban kell tudni mérni az agyszövetben. Ráadásul a módszer kidolgozásánál sikerült a szilárd fázisú extrakciót mintakoncentrálásra is használni, ily módon a meghatározási határ (LOQ- Limit of Quantitation) csökkent.A kromatográfiás módszert is megváltoztattam. Eluensként már nem acetonitrilt használtam (ami megfelelő volt a korábban alkalmazott acetonitriles kicsapással kapott mintákhoz), hanem metanolt. Az izokratikus módszer helyett gradiens módszerrel mértem. Már ezek a változtatások is javítottak a módszer teljesítményjellemzőin, de még egy javításra volt módom. Úgynevezett core-shell kolonnát próbálhattam ki, ami csak a felülethez közeli részen porózus szilikagél szemcsékből áll. A szemcsék közepe tömör. Ezzel a technikával ugyanolyan elválasztást érhettem el jóval rövidebb idő alatt (kb. 2/3-ára csökkent a kromatogram hossza).Megvizsgáltam a továbbfejlesztett módszer alkalmazhatóságát kísérleti állatokból vett agymintákon. Egy fél egéragyat a mintelőkészítés centrifugálási lépése után 5 egyenlő részre osztottam (azért 5 részre, mert a későbbiekben vizsgálni kívánt hippokampusz minták tömege 5-öde a félagy tömegének), és az SPE protokollt 5 párhuzamos oszlopon végeztem. Ezután megnéztem a mérések szórását. Amelyik anyagra volt saját belső standard (anandamid, OEA) illetve amelyik anyaghoz volt nagyon hasonló beldső standard (PEA), azokra 5% körüli szórást kaptam. A másik 2 mérendő anyagra nagyobb szórás adódott (10%), de ez még mindig abban a tartományban van, amit biológiai minták mérésénél elfogadottnak tekint a szakirodalom.Egyeztetve a kutatási partnerekkel (KOKI), a módszert ebben a formában szeretnénk felhasználni hippokampusz minták mérésére. A cél az, hogy összehasonlítsuk ezen lipidek mennyiségét vad típusú illetve KO (egy enzim hiányzik) egerek esetén.