Az agy működésében szerepet játszó endocannabinoid vegyületek vizsgálata
Kutatási beszámoló
Tóth Blanka
2010.02.01-2010.06.30
Az endokannabinoidok a vadkender (Cannabis sativa, marihuána) fő növényi hatóanyagaként ismert Δ9-tetrahidro-kannabinol molekuláris célpontjain, az 1-es és 2-es típusú kannabinoid receptoron (CB1-en és CB2-n) fiziológiásan ható, a szervezetünkben endogén módon megtalálható bioaktív lipidszármazékok. Az elsőként felfedezett és legismertebb, CB1-agonistaként viselkedő anandamid (N-arachidoniletanolamin) mellett a másodikként leírt 2-arachidonil-glicerin (2-AG) a legismertebb endogén kannabinoid molekula. Ahogy az endokannabinoidok kutatása intenzívebbé vált újabb vegyületek jelentőségére derült fény. Ilyen az oleoil-etenolamid (OEA) illetve a palmitoil-etanolamid (PEA).A különböző biokémiai folyamtok ezen vegyületek mennyiségének megváltozásával járnak. Munkám célja ezen 4 lipid kvantitatív meghatározása volt agyszövetből. A méréshez szükséges biológiai mintákat (agyszövet, gerincvelő) a Magyar Tudományos Akadémia Kísérletes Orvostudományi Kutatóintézet biztosította. A biológiai folyamatok leírását, értelmezését is ők végzik.Az analitikai módszer kidolgozásánal elsőként minden anyagra tömegspektrometriás módszert dolgoztam ki. A kvantitatív mérésekhez használt MRM (Multiple Reaction Monitoring) funkció alkalmazásával kaptam a lehető legérzékenyebb és legszelektívebb módszert.Ezután izokratikus kromatográfiás módszert dolgoztam ki a vegyületek elválasztására.A mintaelőkészítés optimálásánál figyelembe kellett venni, hogy nem állt rendelkezésünkre belső standard. Ezért a lehető legkevesebb lépésből állő mintaelőkészítést kellett alkalmazni. Így egy pufferes közegben való ultahangos homogenizálás után acetonitrillel kicsaptam a mintából a fehérjéket, és centrifugálás után a felülúszó közvetlenül injkektálható volt a HPLC/MS/MS rendszerbe.A módszer ellenőrzésére azt a módszert választottam, hogy különböző tömegű agydarabokból kiindulva nyert csúcsterületeket hasonlítottam össze. Az eredményeket agytömeg-csúcsterület diagramon ábrázolva egyenest kaptam, ami megfelelt az elvárásoknak.Valódi minták mérésénél azonban több probléma is felmerült, amik a módszer változtatását indokolták.Lehetőségem adódott, hogy Dr. Heather Bradshow laboratóriumában (Bloomington, USA) tanulmányozhattam a mérést. Nyilvánvalóvá vált, hogy belső standard alkalmazására szükség van, illetve, hogy ennek köszönhetően a mintaelőkészítés is javítható.A későbbiekben tehát a módszer javítása, illetve „éles” minták vizsgálata a célom.